Проблемы диагностики редких заболеваний

Качественный метод – тонкослойная хроматография – находит применение в скрининге наследственных болезней обмена аминокислот, мукополисахаридов и олигосахаридов. Газовую и высокоэффективную жидкостную хроматографию, а также комбинацию хроматографии и массспектрометрии применяют для количественного анализа метаболитов.

Масс-спектрометрия – сложный аналитический метод, который основывается на измерении массы молекул, входящих в состав исследуемых веществ. На первом этапе производится ионизация, т. е. превращение нейтральных молекул и атомов в заряженные частицы (ионы). Далее ионы разделяются в зависимости от уникального соотношения их массы и заряда, и осуществляется их детекция. Тандемная масс-спектрометрия подразумевает использование более одного масс-анализатора, т. е. прибора, осуществляющего разделение ионов. Это позволяет проводить одновременную количественную оценку тысяч метаболитов, причем без длительной пробоподготовки. Данный метод является одним из наиболее перспективных и применяется для диагностики широкого спектра болезней обмена (аминоацидопатии, органические ацидурии, дефекты митохондриального бета-окисления).

Оценка на уровне продукта гена обычно подразумевает измерение активности фермента. Такой подход применяется при лизосомных болезнях накопления и некоторых гликогенозах. Желание предупредить заболевание или ослабить его проявления диктует необходимость неонатального биохимического скрининга. Существующая в России программа скрининга пяти заболеваний (муковисцидоз, фенилкетонурия, врожденная гиперплазия коры надпочечников, галактоземия, врожденный гипотиреоз) продемонстрировала свою полезность для ранней диагностики наследственных заболеваний; она позволяет принять эффективные меры, способствующие увеличению продолжительности и улучшению качества жизни больных. Методы ДНК-анализа играют важнейшую роль в диагностике хромосомных и моногенных заболеваний. При подозрении на хромосомную патологию наиболее часто применяется кариотипирование, чтобы оценить количественные и структурные аномалии хромосом. Данный метод позволяет надежно детектировать делеции, дупликации, транслокации и инверсии генетического материала. Кариотипирование является единственным «традиционным» методом, который можно использовать, не имея четкой гипотезы о природе заболевания, – он позволяет оценить состояние хромосомного аппарата клеток пациента в целом, без привязки к какому-либо «кандидатному» локусу.

Использование флуоресцентных зондов, комплементарных определенным участкам хромосом, лежит в основе метода FISH (флуоресцентная гибридизация in situ). FISH позволяет исследовать широкий спектр хромосомных повреждений (делеции, дупликации, инверсии, транслокации); в качестве объекта для анализа выступают те гены или участки хромосом, поражение которых является индикативным для того или иного заболевания. FISH применяется в диагностике синдромов Прадера – Вилли, Ангельмана, Ди Джорджи, аномалий половых хромосом, лейкозов.

Метод гибридизации по Саузерну (Southern blot) также основан на детекции участков генома с использованием комплементарных зондов. В то время как FISH идентифицирует генетический материал непосредственно в самой клетке, использование Саузерн-блота предусматривает выделение изучаемой ДНК и ее фиксацию на специальных мембранах.

После изобретения полимеразной цепной реакции (ПЦР), Саузерн-блот практически перестал применяться в рутинной диагностике. Однако в некоторых областях, например, при анализе количества CGG повторов в гене FMR1 при подозрении на синдром Мартина – Белл, этот метод попрежнему используется; это связано с тем, что ПЦР оказывается непригодной для анализа участков ДНК большого размера. Количественная ПЦР используется для оценки «дозы гена» и применяется, в частности, для экспресс-анализа хромосомных анеуплоидий. Принцип метода заключается в одновременной амплификации гена-мишени и гена-рефери. Вывод об изменении дозы гена делается на основании анализа соотношения сигналов, продуцируемых амплификатами изу чаемой и референсной последовательностей.

Классическое капиллярное секвенирование по Сэнгеру по-прежнему остается «золотым стандартом» ДНК-диагностики. Вместе с тем высокая стоимость реагентов и трудоемкость делают этот метод малопригодным для исследования большого количества генов. Метод Сэнгера основывается на ферментативном синтезе комплементарной цепи ДНК на матрице анализируемой генетической последовательности. В реакционную смесь включаются не только стандартные нуклеотиды (А, Г, Ц и Т), но и их производные, терминирующие реакцию. Точное измерение синтезированного фрагмента (с разрешающей способностью до 1 пары оснований), а также использование специфических к каждому основанию ДНК флуоресцентных красителей позволяют установить, на каком именно нуклеотиде и в какой позиции произошла остановка реакции. Таким образом, разделение синтезированных фрагментов методом высокоразрешающего электрофореза делает возможной декодировку нуклеотидной последовательности изучаемого участка ДНК.

Метод мультиплексной лигазозависимой амплификации (multiplex ligation-dependent probe amplifi cation, MLPA), разработанный голландской компанией MRC Holland, применяется для детекции небольших делеций и дупликаций. Принцип метода заключается в одновременной амплификации всех экзон-специфических фрагментов изучаемого гена; в случае делеции или дупликации одного или нескольких экзонов наблюдается дисбаланс между количеством вовлеченных и невовлеченных в генетическое повреждение ПЦР-продуктов. Эта техника, в частности, получила распространение в диагностике микроделеционных синдромов (синдром 22q11, синдром Вильямса и т. д.) и во многих ситуациях является более доступной альтернативой FISH.

Среди всех методов диагностики, один из самых доступных и популярных - флюорография. Врачи рекомендуют регулярно - один раз в год - проходить данное обследование и получать справку ФЛГ. Это один из самых информативных диагностических методов обследования внутренних органов человека. Возможности лабораторной диагностики орфанных болезней в настоящее время ограничены – в распоряжении врачей имеются протоколы и/ или тест-системы для выявления всего лишь нескольких сотен редких заболеваний. Для многих орфанных патологий первичный генетический дефект остается неизвестным; в качестве примера можно привести синдромы Айкарди или Мебиуса.

Нередко ситуация осложняется высокой клинической и генетической гетерогенностью заболевания, что снижает диагностическую ценность отдельных, «точечных», тестов, при этом существенно увеличивая стоимость исследования. В перспективе эту проблему должно решить внедрение высокопроизводительных методов геномного анализа.

Компаративная геномная гибридизация на микрочипе (arrayCGH) является относительно новым молекулярно-цитогенетическим методом, позволяющим детектировать увеличение или уменьшение копийности хромосомных локусов в масштабе всего генома. По сути, CGH является разновидностью прецизионного кариотипирования.

В качестве инструмента используется мембрана (микрочип), на которой расположены тысячи локус-специфических ДНК-фрагментов. Анализируемая ДНК гибридизуется с подобным микрочипом; каждый сигнал соответствует определенному локусу генома, а изменение интенсивности сигнала свидетельствует об изменении копийности того или иного участка хромосом. В то время как предел чувствительности «классического» кариотипирования составляет приблизительно 5–10 млн пар оснований, arrayCGH способна достигать разрешения менее 100 тыс. нуклеотидов. Этот метод крайне полезен для диагностики пациентов-детей с дисморфиями, имеющими нормальный кариотип. Вместе с тем необходимо отметить, что arrayCGH неспособна детектировать сбалансированные хромосомные перестройки. Широкое применение данной технологии ограничивается высокой стоимостью микрочипов.

Кроме того, наличие в человеческом геноме полиморфных участков с вариабельной копийностью (copy number variation, CNV), медицинская значимость которых часто неизвестна, влечет за собой сложности при интерпретации результатов. Важнейшим технологическим прорывом в молекулярной медицине стало появление т. н. секвенирования нового поколения (next generation sequencing, NGS; massive parallel sequencing). Данный термин объединяет группу подходов, предложенных различными фирмами (Roche, Illumina, Life Technologies) и основанных на одновременном параллельном секвенировании миллионов коротких фрагментов ДНК с последующей «сборкой» генома.

Сравнение результатов анализа с референсной последовательностью позволяет выявить практически любые виды мутаций в масштабах всего генома или отдельных его частей. Полногеномное секвенирование (whole genome sequencing, WGS) дает возможность одномоментного анализа всех известных на сегодняшний день генов. В ходе экзомного секвенирования (exome capture sequencing) производится «захват» (capture) и обогащение исключительно кодирующих последовательностей генома. Несмотря на свою недолгую историю секвенирование нового поколения хорошо зарекомендовало себя в качестве мощного инструмента медицинской генетики – оно уже позволило обнаружить целый ряд генов, причастных к развитию редких заболеваний. В частности, за последние несколько лет при помощи массивного параллельного секвенирования были открыты генетические причины синдромов Кабуки, Миллера, Фаулера, Сенсенбреннера и т. д..

Диагностическое применение полногеномного секвенирования пока ограничено высокой стоимостью анализа, необходимостью приобретения дорогостоящего оборудования и сложностью биоинформатической обработки огромного массива полученных данных. Экзомное секвенирование, подразумевающее анализ не более 1% всего генома, имеет значительно лучшие краткосрочные перспективы для внедрения. Анализ экзома, по-видимому, достаточен для детекции подавляющего большинства патогенных мутаций. Крайне важно, что использование экзомного секвенирования позволяет проводить диагностический поиск без четкой предварительной гипотезы, т. е. является наиболее оправданным в тех случаях, когда установление диагноза на основании клинических признаков и результатов традиционных исследований (биохимия, кариотипирование, FISH, отдельные молекулярно-генетические тесты) затруднительно.

Существует также вариант экзомного секвенирования, основанный на выборочной расшифровке кодирующих последовательностей ограниченного числа произвольно выбранных генов. Такой мультигенный анализ наиболее пригоден для диагностики заболеваний, развитие которых может быть связано с повреждением одного из десятков или сотен (!) генов, т. е. характеризующихся высокой генетической гетерогенностью. Примерами таких патологий являются несиндромальная глухота, пигментный ретинит, спиноцеребеллярные атаксии, кардиомиопатии, болезнь Шарко – Мари – Тус. Вероятно, накопление данных, полученных с помощью высокопроизводительного секвенирования, приведет к тому, что многие заболевания, которые сейчас относят к категории мультифакториальных (аутизм, некоторые психиатрические и неврологические болезни), в недалеком будущем перейдут в группу состояний, вызванных редкими мутациями…